膠原誘發的關節炎與人類風濕病關節炎具有共同的免疫學和病理學特征，因此CIA模型被廣泛應用于研究致病機理及治療方法的研究。盡管關節炎模型是可復制的，但要成功誘導高發病率和嚴重程度的關節炎，一些影響造模因素需要考慮。

以下是成功誘發小鼠關節炎的一些重要因素。在造模之前，特別是對于首次造模者，這些因素需要提前考慮到。然而，正如其它生物模型，不同研究單位的方案有所不同，因此，每個研究者需要確定自己的研究方案。

動物管理與飼養

動物必須是7-8 周齡健康的并在SPF條件下飼養的動物。一般來說，對于腸道菌群，不管是否致病都顯著影響宿主對抗原的免疫應答。濾過性毒菌和細菌感染也會影響機體對膠原的免疫應答及關節炎進展。例如：感染肝炎病毒（MHV）的小鼠，不能夠誘發關節炎。飲食也會影響關節炎的發病率和嚴重程度，CIA在飼喂不同飲食的小鼠中差異很大。飼喂高脂肪的食物更容易引起高發病率和嚴重關節炎。

小鼠品系

小鼠對CIA的易感性與MHC-Ⅱ類分子相關，同時也取決于接種二型膠原的小鼠品系。有兩個小鼠品系被廣泛應用，因為這兩個品系對CIA高度易感。一個是DBA/(H-2q)小鼠，對雞 牛 豬和人二型膠原有免疫應答，另一個品系B10.RⅢ(H-2r)小鼠，對牛和豬的二型膠原有免疫應答，對雞和人二型膠原有較弱的免疫應答。兩個品系對小鼠的二型膠原都有較弱的免疫應答，小鼠二型膠原的抗體水平低于關節炎抗體水平的1%。因此，如果用小鼠的二型膠原免疫小鼠的話，關節炎發生率約為10%。列表為用于CIA及CAIA 動物模型研究的小鼠品系.

另一方面，CIA抗性的小鼠不總是不產生關節炎抗體。最近研究表明，對CIA的敏感性不僅取決于MHC 類型，同時CIA抗性的小鼠C57BL/6, 129/Sv(H-2b), and Balb/c (H-2d) ，當INF-r 和IL-10 基因敲除后，小鼠能產生針對的關節炎自身抗體。這表明，對關節炎的敏感性也取決于不同細胞因子水平。

佐劑

完全佐劑對于誘發小鼠關節炎是很重要的。不同于大鼠，用二型膠原加IFA免疫小鼠，不產生關節炎。抗體產生，包括IgG2a抗體對于激活補體及隨后的關節炎的發生具有重要作用，取決于完全佐劑中結核桿菌的含量。最近，Campbell 用CFA（5mg/ml）在對CIA抗性的小鼠中成功誘發高發病率的關節炎（50-70%），例如：C57BL/6, B10, and129/Sv mice (H-2b). ，完全佐劑濃度（結核桿菌含量）取決于各研究單位動物管理委員會推薦。

膠原

因為去糖基化的膠原會影響關節炎的產生，同時一些未去除的雜質比如：胃蛋白酶可能會導致T細胞刺激試驗中產生假陽性，因此Ⅱ型膠原應按規定高度純化。如果按恰當的方法凍干的膠原-20℃避光保存的條件下，是非常穩定的。純化的膠原溶于0.05M濃度的醋酸中，終濃度為2-4mg/mL，溫和攪拌，4℃過夜。膠原溶液在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。Chondrex 公司提供較完整的不同免疫級別的Ⅱ型膠原。（見表1） 

表1 不同種屬來源Ⅱ型膠原

乳劑的制備

1）乳劑的質量對于誘發關節炎有至關重要的重要。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導致乳劑不能夠有效的、穩定的誘發關節炎。此外，超聲波處理方法，至少將膠原分成2個片段，這些小片段在正常體溫下，很容易變性。推薦使用電動的高速攪拌器：

用高速攪拌器（帶直徑≤5mm的刀片，Fig.1）攪拌不完全佐劑（IFA）和膠原溶液(Fig 2a)。如果刀片夠不到注射器低端，可以把5mL或10mL的注射器從活塞處剪去一半（Fig.2b）。把注射器夾緊，固定在鐵架臺上，并冰浴。最后一步很重要，因在攪拌過程中會發熱，會引起蛋白變性，變性的蛋白不能夠誘發關節炎（CIA）。

2）加1體積（最多2.5mL）完全佐劑（不完全佐劑在加強免疫時用到）到注射器，再加等體積的膠原溶液（0.05M醋酸溶解的的膠原溶液，終濃度2mg/mL），邊低速攪拌邊滴入膠原溶液。

３）繼續混合，直到在最大轉速產生穩定的乳液（轉速約３0０００rpm/2-3 min）。在再次混合前確保乳液是冰浴中。對于大體積（2-5Ml）為了使乳液混合均勻，建議在混勻過程中移動攪拌位置。

注：可能需重復攪拌2-3次

4)將一滴乳劑滴與一燒杯水中，檢測乳劑的穩定性。如果乳劑是穩定的，在水中是成團的，不散開。

 注：如果乳劑在水面散開，表明乳劑不穩定。再加幾滴佐劑，重新混合后，再檢測。

5）將乳劑轉移到1mL Hamiton 玻璃注射器。不加建議采用塑料注射器，因為很難做到一個準確的注射劑量。

注1：通過用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器（活塞部向下）。否則很難做到一個精確的注射劑量。

注2：建議在乳劑制備好的一小時內，注射完畢。乳劑在在用前一直保持4℃。

免疫部位

在鼠尾根部注射0.1mL(膠原：100μg)乳劑（Fig.4）。例如：從尾根部50px處插入針頭，直到針尖插入位置距尾根部12.5px。針插入皮下且每次注射充分擦拭，防止乳液的露出。針頭沿斜向上與鼠尾方向平行插入。如果要加強免疫，注射部位在尾根部3Cm處，針尖插入皮下據鼠尾根部37.5px處。

注1：背部皮下注射也非常有效，但需注射更多的膠原乳劑（0.5-1Ml）。

注2：無論如何，我們不建議背部皮下注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑，如初次免疫或加強免疫。因為不完全佐劑在腹膜和腹腔引起嚴重的炎癥反應。

免疫程序

Ⅱ型膠原的自身IgG抗體水平及其亞型（可激活補體），對關節炎的發生很重要。依據實驗目的有很多種方法可誘發高發病率的關節炎。

a.      通過單次免疫（無加強免疫）誘發關節炎

依據說明書方法制備乳劑-膠原-完全佐劑（4mg/ml）和免疫，對于一些易感品系如DBA/(H-2^q)和B10.RⅢ(H-2^r)，將會在3.5-4周引發關節炎，6-8周發病率達90-100%。關節炎嚴重程度，臨床評分可達到10-12分（最高16分）。

注：由于高濃度的結核桿菌，一般免疫部位的炎癥程度會很高。因此，可選用b 或C 方案。 b 通過加強免疫誘發關節炎\

按上述方法制備乳劑和免疫，初次免疫CFA（1mg/ml）。7天或21天后用膠原和不完全佐劑加強免疫。尾部皮下注射0.05-0.1ml乳劑，避開初次免疫部位，多點注射。初次免疫后4-4.5周后發病。6-8周發病率在80-100%，臨床評分可達8-12分（最高16分），比方案A關節炎程度少輕。

C通過LPS加強免疫

LPS和體內二型膠原自身抗體水平對于誘發關節炎具有協同效應。此外，經典的CIA ，免疫LPS(B細胞分裂素)或MAM(支原體產生的T細胞分裂素)或SEB(金黃色葡萄球菌產生的T細胞分裂素)后，都會加強關節炎程度。因此這些毒素不僅用于引發和加強關節炎水平而且用于指定關節炎發生時間。。

按方案B,免疫二型膠原和CFA 乳劑。25-28天或在在關節炎想發生的3-5天前腹腔注射LPS(25-50ug)。關節炎將在24-48小時發生，發病率90-100%。

D 用高劑量的CFA加強免疫

    對于一些CIA抗性的小鼠，例如：B10 (H-2^b), C57BL/6 (H-2^b),and C57BL/6x129/Sv (H-2b) ，以下方案。按上述方案制備膠原和佐劑（5mg/ml）,尾部注射0.1ml。然而，有必要用高濃度的CFA 加強免疫。21天后，加強免疫，制備膠原和佐劑（5mg/ml）,尾部注射0.1ml。4-6周發病，6-7周發病率在50-70%。

臨床評分

關節炎可通過臨床評分來定性評估或用測厚儀來測量爪子厚度來評估。這些方法適用于所有的關節炎模型比如經典的CIA，佐劑誘導的關節炎和棉線誘導的關節炎。

表2  關節炎炎癥程度的臨床評分